Validación analítica de una PCR cuantitativa en tiempo real para la detección de ADNSat de Trypanosoma cruzi: cálculo de la precisión, linealidad y límite de detección. Póster

Abstract

Introducción y objetivos: La enfermedad de Chagas es producida por el parásito Trypanosoma cruzi. La detección de ADN del parásito en sangre contribuye al diagnóstico de la infección y al monitoreo de la misma en pacientes trasplantados que puedan sufrir tanto una reactivación o una primo-infección por recepción de órgano infectado. Se propuso validar analíticamente una PCR en tiempo real cuantitativa qPCR para la detección de ADN satélite (ADNSat) de T. cruzi, mediante el cálculo de la precisión, linealidad y límite de detección (LOD). Esta técnica fue transferida desde el Instituto Nacional de Parasitología Fatala Chabén (INP).

Métodos: El protocolo para la determinación de la precisión se llevó a cabo durante 20 días consecutivos utilizando 5 niveles de concentración: 0,5;1;10;100 y 1000 equivalentes-Parasitarios/ml realizados por duplicado a partir del estandar 100000 eq.Par./ml (provisto por el INP) siguiendo los lineamientos del CLSI EP5-A2. Para la linealidad se utilizaron los mismos niveles de concentración por triplicado en una corrida según el CLSI EP6-A y se calculó la misma con el programa LinChecker. Para la validacion del LOD se realizaron 40 replicados de la concentración 0,5eq.Par./ml y 40 replicados de un pool de ADN testeado libre de T. cruzi (blanco). Los reactivos fueron utilizados en las mismas concentraciones que el INP. Se utilizó un termociclador Z480 de Roche Resultados: El análisis estadístico de la precisión intralaboratorio derivó en los siguientes resultados expresados en unidades de Ct: para la concentración más baja de 0,5 eq.Par./ml fue de CV% 3,72 y para la concentración más alta de 1000 eq.Par./ml el CV% fue de 1,26. La repetibilidad arrojó para la concentración más baja un CV%:2,44 y para la más alta CV%:0,33. La metodología fue estadísticamente lineal en el rango analizado. En todos los ensayos se detectó ADN en la dilución más baja de 0.5 y nunca hubo detección en el blanco. Conclusiones: La validación de requisitos técnicos de la qPCR permite conocer el desempeño de esta metodología para asegurar un resultado confiable. La validación analítica fue óptima. Esta herramienta permite detectar y cuantificar ADNSat del parásito tempranamente y es importante para instalar un tratamiento precoz